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¿Cómo usar pegamento de separación? - parte 1

Vistas:0     Autor:Editor del sitio     Hora de publicación: 2022-09-07      Origen:Sitio

Cómo utilizar pegamento de separación?

Transferencia de membrana de transferencia Western

Bajo la acción de la corriente, la proteína se transfiere del gel al portador sólido (membrana).

Selección de membrana: los materiales de fase sólida comúnmente utilizados en la impresión incluyen membrana NC, DBM, DDT, membrana de nylon, PVDF, etc. Elegimos PVDF (fluoruro de polivinilideno), que tiene una mejor adsorción de proteínas, fuerza física y una mejor compatibilidad química. Hay dos especificaciones: Immobilon-P (0.45um) e Immobilon PSQ (0.2um para MW <20kDA).

Un método semi seco

Es decir, la combinación entre capas de gel se coloca entre el papel de filtro con el búfer de transferencia, y la corriente se realiza a través del búfer adsorbido en el papel de filtro para lograr el efecto de transferencia. Debido a que la actual actúa directamente sobre el pegamento de la película, las condiciones de transferencia son relativamente duras, pero el tiempo de transferencia es corto y la eficiencia es alta.

(1) Selección de condiciones experimentales

La corriente es de 1 mma y cm2, y generalmente usamos 100MA / membrana. El tiempo de transferencia se puede seleccionar de acuerdo con el tamaño de la molécula de proteína objetivo y la concentración de gel, y se puede ajustar adecuadamente de acuerdo con la situación real.

Tamaño molecular de proteína objetivo (KDA), concentración de gel y tiempo de transferencia

80 --- 140 8% 1.5-2.0

25 --- 80 10% 1.5

15—40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) Operación experimentalProveedor de tubo de gel de suero - Smail

(1) Preparación de papel de filtro y membrana (la preparación se iniciará 20 minutos antes de la electroforesis).

R. Compruebe si hay suficientes buffers de transferencia, que no se preparan de inmediato.

B. Verifique si hay papel de filtro y membrana del tamaño adecuado.

C. Sumerja la membrana en metanol durante aproximadamente 1-2 minutos. Y luego transferido al búfer de transferencia.

D. Remoje el papel de filtro adhesivo apropiado y el papel de filtro de membrana en el búfer de transferencia respectivamente.

¿Cuánto tiempo debe remojar la membrana PDVF en metanol al ingresar al tampón de transferencia?

PVDF es hidrófobo y es difícil empaparse en el tampón de transferencia. Después del tratamiento con metanol, es más fácil empaparse. El pretratamiento de PVDF es remojarlo y activarlo con metanol, y luego lavarlo dos veces con agua destilada después de remojar a fondo. El propósito de usar burbujas de metanol es activar los grupos cargados positivamente en la membrana PVDF y facilitar la unión con proteínas cargadas negativamente.

La gente generalmente lo usa durante 5-20 minutos. Se puede empapar al mismo tiempo que tomar el pegamento, y se estima que tomará unos 5 minutos. El efecto no es malo. En el pasado, algunos amigos web publicaron que el tiempo de procesamiento no importaba mucho, pero la clave era la calidad de la película. Eso es cierto. Mientras la membrana esté completamente empapada, debería estar bien.

La especificación de PVDF de Hybond se lee de la siguiente manera: "Pre húmedo la membrana en 100% de metanol (10 segundos) ". Entiendo que está bien empaparse durante al menos 10 segundos. De hecho, está bien remojar durante 10 segundos o 10 minutos.

(2) Transferencia

A. Coloque el papel de filtro inferior en el instrumento de transferencia eléctrica. Generalmente se usan tres capas.

B. Coloque la membrana en el papel del filtro contra la membrana, preste atención para no tener burbujas entre la membrana y el papel del filtro, y vierta un poco de buffer de transferencia en la membrana para mantener la membrana húmeda.

C. Pele el pegamento, retire el gel de la pila y muévalo cuidadosamente a la película.

D. Corte la esquina superior izquierda de la película y marque la posición de pegamento en la película con un lápiz.

E. Cubra un trozo de papel de filtro contra el pegamento en el pegamento. Vierta un poco de buffer de transferencia y coloque dos piezas de papel de filtro.

F. Instale el instrumento de transferencia eléctrica y seleccione la corriente y el tiempo requeridos de acuerdo con las necesidades.

G. Durante el proceso de transferencia, el cambio de voltaje se observará en cualquier momento, y cualquier anormalidad se ajustará a tiempo.

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